Imagen de los estereocilios de células sensoriales del oído interno adquirida con el microscopio de barrido de conductancia iónica. Imagen de Yuri Korchev.

Quizá el mayor sueño de cualquier científico dedicado a las ciencias de la vida consista en poder ver a tiempo real un proceso biológico a nivel molecular. Este sueño se encuentra cada vez más cerca del mundo real gracias a un artículo publicado a finales de los ochenta, a un científico inspirado por la idea desarrollada en ese trabajo y a la confianza y el riesgo asumido por su jefe. Sabemos la historia que hay detrás de este avance en nanociencia gracias a Ainara López Córdoba, estudiante predoctoral del Instituto de Biología Molecular y Celular (IBMC) que desde 2012 se encuentra en el Imperial College de Londres terminando su tesis doctoral empleando esta herramienta de gran resolución que podría dejar atrás al microscopio electrónico en pocos años.

Rumbo a Londres

El electrofisiólogo ucraniano Yuri Korchev desembarcó en Londres desde Rusia en el Saint George´s Hospital Medical School en 1991 con un contrato posdoctoral Wellcome Trust, pero él no tenía intención de regresar a Rusia una vez cumplido el plazo estipulado, así que comenzó a moverse para evitar su regreso forzoso. Contactó con Max Lab, quien entonces trabajaba en el Charing Cross Hospital School (que posteriormente se fusionaría con el Imperial College) en fisiología cardiaca utilizando corazones de cerdo como modelo. Necesitaba un electrofisiólogo. Lo que Lab no imaginaba antes de conocer a su nuevo “postdoc” es que cambiaría el rumbo del trabajo de su laboratorio. Yuri traía bajo el brazo una idea: el desarrollo del microscopio de barrido de conductancia iónica (en inglés scanning ion-conductance microscope, SICM).

Basado en el trabajo publicado por el profesor de la Universidad de California Paul Hansma en el que describe el principio de una técnica que permite obtener imágenes del relieve de una superficie mediante el escaneado con una micropipeta, Yuri comienza a desarrollar este sistema para poder analizar muestras biológicas in vivo y con mayor resolución. No sólo lo consiguió, sino que la tecnología desarrollada sigue incorporando nuevas mejoras. A día de hoy, esta técnica permite una nueva aplicación de la nanopipeta utilizada para obtener las imágenes topográficas de alta resolución, es decir, se ha convertido además en una herramienta de aplicación cuantitativa y localizada de compuestos químicos sobre las muestras. También puede combinarse con diferentes sondas electroquímicas para medir procesos celulares como la producción de especies reactivas de óxigeno (ROS) o la liberación de neurotransmisores. De este modo, esta nueva tecnología permite tomar imágenes y vídeos de células vivas sin contacto físico al mismo tiempo que se pueden realizar estudios funcionales de diferentes procesos celulares. Las posibilidades para el ensayo de determinados fármacos y para la caracterización funcional de proteínas de membrana son enormes, ya que la mayoría de técnicas microscópicas de gran resolución, como el microscopio electrónico o el microscopio de fuerza atómica, destruyen o matan la muestra biológica y no es posible hacer ensayos funcionales.

La gran apuesta

Eran los primeros años de los noventa y el dinero que entraba en el laboratorio era para sus estudios cardiológicos, no para este prometedor dispositivo. Al menos en teoría. Convencido de las posibilidades del nuevo microscopio, Max Lab facilitó recursos durante el plazo de un año a Yuri Korchev para que desarrollase el equipo en el laboratorio en detrimento del presupuesto de sus corazones de cerdo, la investigación en curso antes de su llegada al laboratorio. A cambio, sólo una cosa: conseguir la imagen de un cardiomiocito de cerdo para su proyecto. Y lo consiguió. Sin embargo, y como suele ocurrir en ciencia, los resultados respecto al SICM no llegaron en el momento que el investigador tenía planeado y Max perdió la financiación de su laboratorio por no haber obtenido los objetivos pactados en su proyecto sobre cardiología. Aun así siguió creyendo en el proyecto y a pesar de la incertidumbre y las dificultades siguió apoyando a Yuri y al equipo que se fue creando en torno al desarrollo del SICM. Dos colaboraciones fueron vitales para que el nuevo microscopio se convirtiese en realidad. Andrew Shevchuk y Pavel Novak fueron quienes afrontaron los retos técnicos que separaban la idea de Yuri de la bancada de laboratorio, el primero se encargó de los retos “analógicos”, haciendo posible el diseño de una máquina funcional y precisa; el segundo lidió con el aspecto digital, el desarrollo de un software de uso sencillo y al mismo tiempo capaz de controlar y coordinar un gran número de parámetros con la mayor exactitud.

Fueron años de duro trabajo que finalmente dieron su fruto: un microscopio capaz de tomar imágenes y vídeos de células vivas a nivel nanométrico y una empresa, Ionscope, para comercializar esta tecnología. En opinión de Ainara López Córdoba, se trata de una herramienta muy útil y sofisticada, la cual están intentando que el mundo conozca y utilice. Por ello, los miembros del equipo se encuentran en las instituciones donde tienen sus plazas investigadoras desarrollando sus propios equipos para las distintas aplicaciones que permite el SICM, incluidas las que permiten su acoplamiento a distintos tipos de microscopios para que ningún proceso celular escape a los ojos del científico.

Concretamente, Yuri se encuentra actualmente en el Imperial College, dentro del London Centre for Nanotechnology, en cuyo laboratorio trabaja Ainara merced a sus estudios de doctorado con el investigador y director del IBMC Antonio Ferrer. Ainara está poniendo a punto el sistema para la aplicación local de capsaicina, con el objetivo de conocer la distribución del canal de membrana activada por la misma. Recientemente han publicado este trabajo en Biophysical Journal, cuyos pormenores cuenta a continuación la propia Ainara.

“Tenemos como objetivo saber cómo se distribuyen los receptores TRPV1 (canales implicados en la transmisión del dolor) en la membrana de las neuronas sensoriales en condiciones normales y en condiciones inflamatorias, puesto que se ha visto que su expresión se ve alterada en determinadas condiciones inflamatorias.

Con este fin, la idea fue utilizar estas nanopipetas para aplicar capsaicina, el activador de estos canales, localmente en distintas zonas de las neuronas y registrar la respuesta a esa activación, de manera que sólo observaríamos respuesta en aquella zona de la membrana en la que se expresen estos canales. La primera misión a la que nos teníamos que enfrentar era saber cuánta capsaicina estábamos aplicando, y qué área de la neurona estábamos cubriendo con dicha aplicación.

Para ello, a fin de desarrollar un sistema de aplicación cuantitativo y local, utilizamos un mediador redox que se oxida y se reduce en función del voltaje, y un electrodo de carbono para registrar la corriente en respuesta a la reacción electroquímica que dicho mediador sufre. Rellenamos la nanopipeta con el mediador y registramos la corriente observada en el electrodo de carbono cuando liberábamos diferentes concentraciones del mediador al aplicar diferentes voltajes a través de la nanopipeta y cuando la posición entre electrodo y pipeta variaba. La aplicación a través de la nanopipeta puede compararse a una manguera, cuánto más abres el grifo (cuanto mayor es el voltaje que aplicas a la pipeta) mayor es el flujo de agua que tienes (mayor es la cantidad de compuesto liberada). De esta forma nos fue posible calibrar el sistema para saber exactamente qué concentración estábamos aplicando y cuál era el perfil de distribución en disolución.

Al mismo tiempo colaboramos con un chico en la Universidad de Cambridge, Peter Jönsson, que se encargó de todo el modelado de cómo se distribuye la capsaicina en disolución, cómo el voltaje afecta a su liberación a través de la pipeta y cómo la presencia de una célula debajo de la nanopipeta afecta al perfil de distribución. Así, ya sabemos en función de qué concentración de capsaicina ponemos en la nanopipeta y de qué voltaje aplicamos cuál es el área que cubrimos y qué concentración estamos obteniendo.

Ahora nos enfrentamos al siguiente reto que consiste en registrar la corriente de estos canales mediante la técnica de patch clamp al mismo tiempo que aplicamos capsaicina localmente en diferentes posiciones de las neuronas. De esta manera pretendemos conocer la distribución de los canales en la superficie de la membrana celular”.

Quedamos a la espera de los siguientes pasos, entre los que se incluye la tesis de Ainara.

Max sigue vinculado al Imperial College y todavía visita de vez en cuando a Yuri en su laboratorio. En cada visita se nota el profundo respeto que ambos se profesan. Max es de las pocas personas a las que Yuri siempre hará caso. Y con razón.

(Entrada publicada en el blog de divulgación científica del Instituto de Biología Molecular y Celular)